D-熒光素鉀鹽，D-蟲熒光素鉀鹽；D-Luciferin potassium

分子式：C11H7KN2O3S2    分子量：318.41   CAS 號(hào)：115144-35-9

一：背景簡(jiǎn)介：哺乳動(dòng)物發(fā)光，一般是將螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)基因整合到需觀察細(xì)胞的染色體DNA上，以表達(dá)熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí)，熒光素酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。標(biāo)記后的熒光素酶只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目呈線性相關(guān)。除螢火蟲熒光素酶外，有時(shí)也會(huì)用到海腎熒光素酶(renilla luciferase)。二者的底物不同，螢火蟲熒光素酶的底物是熒光素(D-luciferin,常見鉀鹽或者鈉鹽)。二者的發(fā)光波長(zhǎng)也不一樣，前者發(fā)光波長(zhǎng)在540-600 nm,后者發(fā)光波長(zhǎng)在460-540nm。熒光素所發(fā)的光更容易透過組織，在體內(nèi)代謝較慢，而且特異性好。所以大部分活體成像實(shí)驗(yàn)采用螢火蟲熒光素酶基因作為報(bào)告基因。

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍應(yīng)用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是體內(nèi)活體成像技術(shù)。其作用機(jī)制是在ATP和熒光素酶的作用下，熒光素（底物）能夠被氧化發(fā)光。當(dāng)熒光素過量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，導(dǎo)入研究動(dòng)物如大、小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素，通過生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來檢測(cè)光強(qiáng)度變化，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對(duì)此反應(yīng)體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強(qiáng)度的變化來指示能量或生命體征。

D-熒光素也常用于體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報(bào)告基因分析；高通量測(cè)序和各種污染檢測(cè)。目前有三種產(chǎn)品形式：D-熒光素（游離酸），D-熒光素鹽（鈉鹽和鉀鹽）。主要差別在于溶解特性：前者的水溶性以及緩沖體系的溶解性都較弱，除非溶于弱堿如低濃度NaOH和KOH溶液?？扇苡诩状己虳MSO；后者能夠易溶于水或緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特別適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。配成溶液后的這三種產(chǎn)品，在絕大多數(shù)的應(yīng)用上都沒有實(shí)質(zhì)性的差別。  根據(jù)文獻(xiàn)及客戶使用習(xí)慣，目前使用熒光素鉀鹽的較為常見。

美侖自主研發(fā)的D-熒光素鉀鹽，具有純度高，溶解性好，發(fā)光強(qiáng)度高衰減慢等特點(diǎn)，媲美進(jìn)口產(chǎn)品。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，批產(chǎn)量高達(dá)100克以上。

產(chǎn)品用途：D-Luciferin作為熒光素酶的底物，存在于多種發(fā)光生物體中。在ATP和熒光素酶的催化作用下，熒光素被氧化，產(chǎn)生藍(lán)綠色的光(560nm)，當(dāng)?shù)孜镞^量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)。編碼熒光素酶的Luc基因是植物、細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的常見報(bào)告基因。由于沒有背景干擾，因此可以很容易檢測(cè)出低至0.02 pg水平的熒光素酶。廣泛應(yīng)用與活體成像報(bào)告基因檢測(cè)等領(lǐng)域。

 

二：meilunstar D熒光素鉀產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)及操作方法

技術(shù)指標(biāo)

中文名（Chinese synonym）	D-熒光素鉀鹽；D-蟲熒光素鉀鹽
英文名（English synonym）	D-Luciferinpotassium,D-Luciferin firefly, potassium salt
CAS號(hào)（CAS NO.）	115144-35-9
分子式（Formula）	C11H7N2O3S2 K
分子量（Molecular weight）	318.41 g/mol
外觀（Appearance）	淡黃色粉末
溶解性（Solubility）	易溶于水（30 mg/mL）
純度（Purity）（HPLC）	≥98%
儲(chǔ)存條件：	避光-20℃儲(chǔ)存
運(yùn)輸條件：	2-8度

操作方法

體外生物發(fā)光試驗(yàn)熒光素試劑的制備
材料
—D-熒光素，鉀鹽（D-luciferin，potassium salt ，MB1834）
—無菌純水(美侖貨號(hào)MA0028)
—完全培養(yǎng)基（自行配置）
步驟
1. 用無菌水制備100X熒光素原液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動(dòng)至熒光素完全溶解?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。
2. 將D-luciferin，potassium salt 溶解于預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基中制備成濃度為150 μg/ml的工作液。用組織培養(yǎng)基1∶100稀釋儲(chǔ)存液，配置工作液(終濃度150μg/mL)。
3. 去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
4. 圖像分析前，向細(xì)胞培養(yǎng)板中添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析。
—注射器濾膜過濾除菌，0.2 μ m
*提示：成像前在37℃下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間孵育可增強(qiáng)信號(hào)。

 

活體成像分析
材料 
—D-熒光素，鉀鹽（D-luciferin，potassium salt ，MB1834）
—D-PBS,不含鈣、鎂（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)）(美侖貨號(hào)MA0010)
1：配制溶液

使用無菌D-PBS（w/o Ca2+ ;Mg2+）配制D-熒光素鉀鹽溶液（15mg/ml），0.22µm濾膜過濾除菌（避光），分裝后于-20℃或-80℃冷凍保存，避免反復(fù)凍融。使用時(shí)4℃融化，實(shí)驗(yàn)前平衡至室溫（避光） 

2：注射量取決于注射方式，具體如下：

注射方式	劑量
靜脈注射（25-27gauge針頭）	按10µl/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液
腹腔注射（25-27gauge針頭）	按10µl /g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液
肌肉注射（27gauge針頭）	50µl，濃度為1-2mg/ml熒光素工作液
鼻內(nèi)注射（pipette）	50µl，濃度為3mg/ml熒光素工作液

3： 注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期），再進(jìn)行成像分析。
注意：建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，從而確定最高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期。保存和操作的過程中都要避光。另外水溶性儲(chǔ)存液過濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融。如果有條件，對(duì)儲(chǔ)存液充氮?dú)饣驓鍤猓ǚ乐寡趸€(wěn)定性和保存時(shí)間更長(zhǎng)，長(zhǎng)達(dá)1年。 注射方式，動(dòng)物類型以及體重等都會(huì)影響信號(hào)的發(fā)射，因此建議每次實(shí)驗(yàn)都要做熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，確定最佳信號(hào)平臺(tái)期和最佳的檢測(cè)時(shí)間。熒光素鉀鹽和熒光素鈉鹽應(yīng)用上沒有差別，兩者的差別在于物理性狀上如外形和溶解性。鈉鹽的水溶性高于鉀鹽。從目前發(fā)表的文獻(xiàn)來看，鉀鹽的使用率遠(yuǎn)高于鈉鹽，尤其是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。兩者功效相同。 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 

三：產(chǎn)品測(cè)試結(jié)果展示及文獻(xiàn)發(fā)表

 

1 結(jié)構(gòu)確定（HNMR核磁氫譜）

H-NMR譜圖，由以上譜圖可以看出，美侖產(chǎn)品結(jié)構(gòu)正確。

2 純度檢測(cè)（HPLC高效液相）

 

HPLC譜圖，由以上譜圖可以看出，美侖產(chǎn)品純度非常高。

3 熒光強(qiáng)度驗(yàn)證

 

采用美國(guó)BioTek HTX多功能熒光酶標(biāo)儀，對(duì)meilunstar D熒光素鉀鹽進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)照產(chǎn)品為進(jìn)口P公司。雙盲對(duì)照，結(jié)果顯示，倆者在熒光強(qiáng)度及動(dòng)力學(xué)指標(biāo)上無顯著差異

圖A：D-LuciferinK螢光信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)

 

圖B： D-LuciferinK螢光信號(hào)穩(wěn)定性（動(dòng)力學(xué)）檢測(cè)。等量的螢火蟲螢光素酶，分別加入含有300μg/ml D-LuciferinK 的經(jīng)典螢火蟲螢光素酶發(fā)光緩沖溶液（含 ATP、CoA、Mg2+ ），從反應(yīng)初始時(shí)刻持續(xù)追蹤螢光信號(hào)60s，可以發(fā)現(xiàn)meilunstar D-LuciferinK的螢光信號(hào)強(qiáng)度與信號(hào)穩(wěn)定性均與進(jìn)口公司無顯著差別。（儀器：BioTek HTX） 

4 溶解性測(cè)試

 

室溫條件下，用純水作為溶劑 測(cè)試溶解性，30MG/ML濃度，易溶解，澄清度良好。

5 活體成像實(shí)例。

 

6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)D-熒光素鉀鹽體外生物發(fā)光試驗(yàn)

材料：

—D-熒光素鉀鹽（D-luciferin potassium salt，美侖貨號(hào)MB1834）
—無菌純水（美侖貨號(hào)MA0028）
—完全培養(yǎng)基（自行配制）

步驟：
1. 貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中孵育數(shù)小時(shí)或過夜，使細(xì)胞貼壁。懸浮細(xì)胞：可以將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板后直接進(jìn)行后續(xù)操作，無需孵育。如果倍增時(shí)間相對(duì)較短，則應(yīng)考慮倍增時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.將15mg熒光素鉀鹽溶解于1ml無菌水中，制備成100X熒光素儲(chǔ)備液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動(dòng)至熒光素鉀鹽完全溶解。混勻后立即使用或分裝后-20℃凍存。

3. 用預(yù)熱好的細(xì)胞培養(yǎng)基1∶100稀釋100X熒光素儲(chǔ)備液（15mg/ml），配制成熒光素工作液（終濃度150μg/ml），即配即用。

4. 去除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基。

5. 在成像前，將適量熒光素工作液加入細(xì)胞中，然后進(jìn)行圖像分析。注意：成像前在37℃下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間孵育可增強(qiáng)信號(hào)。孵育時(shí)間取決于特定的細(xì)胞類型。一般來說孵育10分鐘就足夠了，根據(jù)需要進(jìn)行測(cè)試和調(diào)整。

6. 每隔10分鐘，最多40分鐘，使用VILBER FUSION FX成像系統(tǒng)檢查體外生物發(fā)光，確定動(dòng)力學(xué)曲線并找出細(xì)胞的峰值成像時(shí)間點(diǎn)。

 

結(jié)果：（見下圖A）

 

圖A：D-luciferin體外生物發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線。使用美侖D-luciferin檢測(cè)轉(zhuǎn)染pML-NFκB-Fluc2-Neo質(zhì)粒（美侖貨號(hào)MA0504）后的293T細(xì)胞，VILBER FUSION FX成像系統(tǒng)下每5min檢測(cè)螢光信號(hào)一次，持續(xù)追蹤40min。動(dòng)力學(xué)曲線顯示，美侖D-luciferin作為底物的細(xì)胞生物發(fā)光衰減較慢，40min后螢光信號(hào)強(qiáng)度僅衰減25%左右。

 

7 近期使用meilunstar D熒光素鉀鹽發(fā)表文獻(xiàn)舉例

 

(1). Development of a hypoxia-triggered and hypoxic radiosensitized liposome as a doxorubicin carrier to promote synergetic chemo-/radio-therapy for glioma

期刊：BIOMATERIALS 影響因子：10.273

(2)Hypoxia-responsive lipid-poly-(hypoxic radiosensitized polyprodrug) nanoparticles for glioma chemo- and radiotherapy. 

期刊：Theranostics；影響因子：8.06

(3)Theranostic size-reducible and no donor conjugated gold nanocluster fabricated hyaluronic acid nanoparticle with optimal size for combinational treatment of breast cancer and lung metastasis

期刊：JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE  影響因子：7.901

(4)Hypoxia-responsive ionizable liposome delivery siRNA for glioma therapy.  

 期刊：International Journal of Nanomedicine  影響因子：4.47

(5)Self-assembled angiopep-2 modified lipid-poly (hypoxic radiosensitized polyprodrug) nanoparticles delivery TMZ for glioma synergistic TMZ and RT therapy

期刊：DRUG DELIVERY  影響因子：3.829

(6)Angiopep-2 Modified Cationic Lipid-Poly-Lactic-Co-Glycolic Acid Delivery Temozolomide and DNA Repair Inhibitor Dbait to Achieve Synergetic Chemo-Radiotherapy Against Glioma

 期刊：JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY  影響因子：1.093